1. ما هو الفرق بين DDA و DIA؟
تعتبر كل من DDA وDIA من الطرق القائمة على الاكتشاف في تحليل البروتينات من الأسفل إلى الأعلى. وهذا يعني أنه في كلتا الحالتين يتم هضم البروتين إنزيميًا إلى ببتيدات أصغر ويتم استخراج المعلومات من الببتيدات لاستنتاج استنتاجات على مستوى البروتين. في DIA، يتم تجزئة جميع الببتيدات تقريبًا معًا ثم تحليلها باستخدام مطياف الكتلة. تنتج هذه التقنية أطياف تجزئة معقدة (MS2) ولكنها تجمع بيانات MS2 لجميع الببتيدات على مدى نطاق زمن الاحتفاظ بالكامل. بعد هذه الخطوات الأولية، تستخدم طريقة DIA مكتبات طيفية لاستخراج المعلومات من البيانات الغنية للغاية وتسمح بالقياس الكمي على مستوى MS2. نظرًا لهذه الخصائص، توفر DIA دقة لا مثيل لها ودقة كمية، وإمكانية إعادة إنتاج محسنة، وأخذ عينات ببتيد أكثر شمولاً من DDA. على النقيض من DIA، يقوم مطياف الكتلة في وضع DDA باختيار ببتيدات معينة فقط ثم تجزئةها، ومن الناحية المثالية واحدة تلو الأخرى. في حين أن DIA هي طريقة الاستحواذ المتفوقة للأهداف الكمية، فإن DDA هي الطريقة المفضلة لإنشاء المكتبات والبحث في قواعد البيانات بسبب أطياف MS2 الخاصة بالببتيد تقريبًا. وهذا صحيح بشكل خاص عند استخدامه بالتزامن مع التجزئة العميقة. بناءً على خوارزميات محرك البحث المطبقة على قواعد بيانات البروتين الموجودة، يمكن لـ DDA توفير نتائج التعريف بسرعة.
2. ما هو الفرق بين استخدام "مستند فارغ" وإدخال بحث الببتيد DIA؟
سيرشدك إدخال بحث ببتيد DIA خطوة بخطوة خلال النموذج المرسل. يمكنك الحصول على نفس النتائج أو أكثر من خلال تحديد "مستند فارغ" ثم استخدام الإعدادات > إعدادات الببتيد وإعدادات الانتقال، ملف > استيراد FASTA، تحسين > إضافة طُعم، ملف > استيراد > نتائج، تحسين > إعادة دمج النتيجة. بعبارة أخرى، إذا كنت تعرف ما تريد تحقيقه، فيمكنك الحصول على أقصى قدر من القوة والمرونة من خلال التنقل بين الخيارات مباشرة داخل واجهة مستخدم Skyline. إذا لم يكن الأمر كذلك، فقد تجد أنه من الأنسب إدخال خيار بحث ببتيد DIA. بعد تحديد "مستند فارغ"، يمكنك أيضًا إظهار هذا النموذج عبر ملف > استيراد > بحث ببتيد وربما إجراء بعض التعديلات الأولية على الأجزاء المفقودة من نموذج بحث الببتيد.
3. ما هي الاختلافات في طرق الحصول على البيانات بين تحليل البروتينات باستخدام DDA وتحليل البروتينات باستخدام DIA وتحليل البروتينات باستخدام Targeted Proteomics؟ ما هي مزاياها وعيوبها؟
1. مجموعة بيانات اعتماد DDA:
التحليل البروتيني الكلاسيكي للبندقية. يختار مطياف الكتلة الأيونات ذات الكثافة الأعلى في MS1 لتأين MS2.
المزايا: الكشف غير المتحيز عن البروتين. لا يتطلب أي افتراضات مسبقة.
العيوب: نظرًا لاكتشاف ببتيدات مختلفة في عمليات تشغيل مختلفة، فإن إمكانية إعادة إنتاج البروتينات التي تم تحليلها تكون منخفضة ويكون تأثير الدفعة كبيرًا. كما يؤدي ذلك إلى فقدان الكثير من البيانات. هناك خطأ كبير في تحديد البروتين الأكثر وفرة في عينة الاختبار، وخاصة بالنسبة لعينات البلازما حيث يتقلب النطاق الديناميكي لتركيز البروتين على نطاق واسع.
2. جمع مستقل لبيانات DIA:
تختار "النافذة المنزلقة" أيونات MS1 في نطاق نسبة كتلة إلى شحنة معينة لتحليل MS2 اللاحق، وبالتالي تحقيق تحليل المسح لجميع الأيونات.
المزايا: الكشف عن البروتينات بطريقة غير متحيزة. لا يتطلب الأمر أي افتراضات مسبقة. يمكن الكشف عن عدد كبير من البروتينات.
العيوب: يتم الحصول على قدر كبير جدًا من البيانات، مما يؤدي إلى تباطؤ في تحليل البيانات. نظرًا لجمع قدر كبير جدًا من البيانات، يلزم إجراء تحليل معقد للبيانات للحصول على كثافة الببتيدات الفردية، وغالبًا ما يتم استخدام قواعد بيانات الببتيد لهذا الغرض.
3. التصلب المتعدد المستهدف:
قم بإجراء أي نوع من تحليل مطياف الكتلة على الببتيد المستهدف، عادةً ما يكون SRM أو PRM في الواقع، وربما باستخدام معيار النظائر المستقرة (SIS).
المزايا: تأثير أقل على الدفعات. يتيح نظام SIS تحديدًا كميًا أفضل، حتى تحديدًا كميًا مطلقًا. إمكانية إعادة إنتاج جيدة وبيانات قليلة مفقودة.
العيوب: يتطلب تطوير اختبارات مستهدفة. قبل إجراء التجربة، عليك أن تقرر البروتينات التي تريد تحليلها. SIS مكلف.